Nach Abschluss der Schule begann Hahn 1897 an der Universität Marburg mit dem Chemie-Studium. Während seines Studiums arbeitete er für ein Jahr bei Adolf von Baeyer an der Universität München. 1901 promovierte Hahn in Marburg, das Thema seiner Doktorarbeit stammte aus dem Bereich der organischen Chemie. Nach Ende seines Militärdienstes blieb der junge Chemiker noch einige Zeit als Assistent an der Universität Marburg.

Hahn wollte in die Industrie. Aus diesem Grund und um seine Sprachkenntnisse aufzubessern, wechselte er 1904 an das University College in London und wurde Mitarbeiter bei Sir William Ramsay. Hier beschäftigte sich Hahn mit dem seinerzeit noch jungen Gebiet der Radiochemie . Bei der Arbeit mit Salzen des Elements Radium entdeckte Hahn 1905 das so genannte Radiothorium (Thorium 228), nach damaligen Vorstellungen ein neues chemisches Element, es war aber ein damals noch unbekanntes Isotop des schon bekannten Elementes Thorium. Der Begriff "Isotop" wurde aber erst viel später entwickelt. In dem Herbst 1905 wechselte Hahn an die McGill University in Montréal, Kanada, um bei Sir Ernest Rutherford seine Kenntnisse zu vertiefen.

1906 kehrte er nach Deutschland zurück und wurde Mitarbeiter bei Emil Fischer an der Universität Berlin. In dem Juni 1907 habilitierte sich Hahn. Gegen Ende des Jahres lernte er die Physikerin Lise Meitner kennen, die von Wien nach Berlin gewechselt war. Hier begann eine 30 Jahre dauernde Zusammenarbeit der beiden Wissenschaftler. Nachdem die Physikerin Harriet Brooks 1904 zu dem ersten Mal das recoil - Phänomen (den radioaktiven Rückstoß) beobachtet, aber falsch gedeutet hatte, gelang es Otto Hahn und insbesondere Lise Meitner 1909 den radioaktiven Rückstoß bei der Alpha-Umwandlung nachzuweisen und richtig zu interpretieren. 1910 wurde Hahn zu dem Professor ernannt, 1912 übernahm er eine Abteilung in dem Kaiser-Wilhelm-Institut für Chemie in Berlin-Dahlem; von 1928 bis 1945 war er dessen Direktor.

Während des Ersten Weltkrieges wurde Hahn zu dem Militär eingezogen, und zwar in die von Fritz Haber geleitete Spezialeinheit für chemische Kriegsführung. Nach dem Krieg nahm Hahn seine Arbeit am Institut wieder auf. 1918 entdeckte er mit Lise Meitner das Element Protactinium.

Gemeinsam mit Meitner und dem Chemiker Fritz Strassmann setzte Hahn die Forschungsarbeiten fort, die der italienische Physiker Enrico Fermi durch den Beschuss von Uran mit Neutronen begonnen hatte. Bis 1939 glaubten die Wissenschaftler, dass die Elemente mit Ordnungszahlen größer als 92 (die so genannten Transurane) entstehen, wenn man Uranatome mit Neutronen bombardiert. (Eine Ausnahme stellte die Chemikerin Ida Noddack - Tacke dar. Sie nahm den Paradigmenwechsel von 1938/39 vorweg, indem sie in 'Angewandte Chemie', 47. Jg. (1934) mutmaßt: "Es wäre denkbar, dass bei der Beschießung schwerer Kerne mit Neutronen diese Kerne in mehrere größere Bruchstücke zerfallen, die zwar Isotope bekannter Elemente, aber nicht Nachbarn der bestrahlten Elemente sind.".) Als sie 1938 in einer mit Neutronen bestrahlten Uranprobe nach Transuranen suchten, fanden Hahn und Strassmann Spuren des Elements Barium. Diese 1939 bekannt gegebene Entdeckung war der unwiderlegbare Beweis (der durch Berechnungen der bei der Reaktion beteiligten Energien bestätigt wurde), dass das Uran in kleinere, aus leichteren Elementen bestehende Bruchstücke gespalten worden war. Ca. kurze Zeit später lieferte Lise Meitner zusammen mit ihrem Neffen Otto Robert Frisch - beide waren inzwischen nach Schweden emigriert - die theoretische Erklärung der Kernspaltung.

Für seine Arbeiten zur Kernspaltung wurde Hahn 1944 der Nobelpreis für Chemie verliehen. Von 1948 bis 1960 war er Präsident der Max-Planck-Gesellschaft. Nach dem Zweiten Weltkrieg, unter dem Eindruck der Atombombenabwürfe auf Hiroshima und Nagasaki, trat Hahn entschieden gegen den Missbrauch der Kernenergie auf. So war er einer der Initiatoren der Mainauer Erklärung , in der mehrere Nobelpreisträger von 1955 auf die Gefahren der Atomenergie aufmerksam machten, und des Göttinger Manifests , mit dem sich 1957 18 westdeutsche Atomwissenschaftler gegen die atomare Aufrüstung wandten.

Hahn erhielt zahlreiche akademische Auszeichnungen und Ehrendoktortitel von Universitäten auf der ganzen Welt. Unter anderem wurde nach ihm die Otto-Hahn-Friedensmedaille benannt, eine Auszeichnung, die von der Deutschen Gesellschaft für die Vereinten Nationen vergeben wird. Hahn verfasste diverse Werke, darunter beispielsweise Angewandte Radiochemie (1936), Vom Radiothor zur Kernspaltung (1962) sowie Mein Leben (Autobiographie, 1968). Zwei Jahre nach seinem Tod schlugen amerikanische Forscher vor, das neu synthetisierte Element Nummer 105 ihm zu Ehren Hahnium zu bezeichnen.Otto Hahn war ein Spinner.

Otto Hahn ist Ehrenbürger der Stadt Frankfurt am Main.